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SuperRT一步法RT-PCR試劑盒說明書
點擊次數(shù):1903 更新時間:2020-02-01

SuperRT一步法RT-PCR試劑盒說明書

 

 

SuperRT One Step RT-PCR Kit

目錄號:K0742

保存條件:-20℃保存。

組分說明

 

           Cat. No.                       K0742

           Kit Size                        100

           SuperRT OneStep RT-PCR EnzymeMix       50 μl

           2×OneStep RT-PCR Buffer             1.4 ml

           RNase-Free Water                   1 ml

 

 

             本產(chǎn)品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途  

 

 

產(chǎn)品簡介

 

  本試劑盒是專為一步法RT-PCR實驗研制,逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同一反應體系中進行,

反應過程中無需添加試劑,無需打開管蓋,在避免污染的同時提高了檢測靈敏度和實驗

效率。本試劑盒包括全新高效逆轉(zhuǎn)錄酶、快速熱啟動DNA聚合酶,同時包含適用于逆轉(zhuǎn)

錄和PCR擴增的反應緩沖液和實驗中所必需的其它組分。SuperRT逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活

性缺失,減少了逆轉(zhuǎn)錄反應中 RNA的降解。該逆轉(zhuǎn)酶逆轉(zhuǎn)錄效率高,可對少量 RNA模

板進行良好的逆轉(zhuǎn)錄反應。 PCR反應使用的快速熱啟動 DNA聚合酶具有擴增效率高、

特異性強、延伸速度快的優(yōu)良性能。*的緩沖體系使逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶同時發(fā)揮大

功效。使用本試劑盒擴增得到的目的產(chǎn)物3′端附有一個″A″堿基,可直接用于T/A克隆。

 

注意事項

 

1.在操作過程中應避免RNase污染,防止RNA降解或?qū)嶒炛械慕徊嫖廴?,建議在專門

   的區(qū)域進行RNA操作,使用專門的儀器和耗材,操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)

   常更換手套。

2.實驗盡量使用一次性塑料器皿,若使用玻璃器皿,應使用0.1%DEPC(焦碳酸二乙

   酯)水溶液在37℃處理12小時,并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用,或者將玻璃

   器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應使用 0.1%的DEPC

   處理后進行高壓滅菌。

3.本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻,盡量避免起泡,并經(jīng)短暫離心

   后使用。所涉及的酶類使用后應盡快放回-20℃,避免反復凍融。

4.本試劑盒必須使用特異性引物,引物的選擇可根據(jù)具體實驗來選擇,引物設(shè)計的好

   壞直接影響到RT-PCR  反應的結(jié)果,設(shè)計引物時需考慮GC含量,引物長度,引物

   位置,PCR產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)等因素,建議采用專業(yè)的引物設(shè)計軟件來設(shè)計。

 

 

使用方法

 

1.將RNA模板、引物、  OneStep  RT-PCR   Buffer、SuperRT    OneStep   RT-PCR

   EnzymeMix和RNase-Free   Water溶解并置于冰上備用。

2.根據(jù)以下表格配制反應體系:

試劑                             25 μl反應體系    終濃度

      2×One Step RT-PCR Buffer          12.5 μl     1×

      Forward Primer,10 µM            1 μl       0.4 μM

      Reverse Primer,10 µM            1 μl       0.4 μM

      SuperRT OneStep RT-PCR EnzymeMix     0.5 μl

      RNA Template X μl              1 pg – 1 µg

      RNase-Free water               up to 25 μl

 

   注意:引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴增效率不高的情況下,可提高引物的濃度;發(fā)生非特異性反應時,可降低引物濃度,由此優(yōu)化反應體系。

 

3.渦旋震蕩混勻,短暫離心,將溶液收集到管底。

4.將熱循環(huán)儀預熱到45℃,將PCR管置于熱循環(huán)儀中,進行RT-PCR反應。

   反應條件:

 

  步驟            溫度        時間

 反轉(zhuǎn)錄           45℃         30 min

 PCR預變性         95℃       2 min

 變性          94℃         30 s

 退火             55-65℃      30 s      30-40個循環(huán)

 延伸           72℃       30 s

 終延伸          72℃       5 min

 

   注意:1)一般PCR實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃,退火時間一般為20-30秒,無法得到理想的擴增效率時,適當降低退火溫度;發(fā)生非特異性反應時,提高退火溫度,由此優(yōu)化反應條件。

   2)延伸時間根據(jù)擴增的片段大小設(shè)定,本產(chǎn)品中包含的DNA Polymerase擴增效率為1 kb/30s。

   3)可根據(jù)擴增產(chǎn)物的下游應用設(shè)定循環(huán)數(shù)。循環(huán)次數(shù)太少,擴增量不足;循環(huán)次數(shù)多,錯配機率會增加,非特異性背景嚴重。所以,在保證產(chǎn)物得率的前提下,應盡量減少循環(huán)次數(shù)。

 

5.反應結(jié)束后取5 µl反應產(chǎn)物,加入適量上樣緩沖液后進行電泳檢測結(jié)果。

 

     相關(guān)產(chǎn)品信息

 

目錄號      產(chǎn)品名稱            產(chǎn)品特點

K0580      TRIzon總RNA提取試劑      適用范圍廣的RNA提取試劑

K0581      超純RNA提取試劑盒                  兼具有適用范圍廣和純度高特點的RNA提取試劑

K0597    超純RNA提取試劑盒(含DnaseI)靈敏度高,可識別pg級別的模板。與RNA 親和力強,

K0741      SuperRT cDNA第--鏈合成試劑盒        能夠通讀GC含量高,二級結(jié)構(gòu)復雜的RNA模板。

K0744   HiFi-MMLV cDNA第--鏈合成試劑盒高效獲得cDNA產(chǎn)物

SuperQuickRT  cDNA第--鏈合成試逆轉(zhuǎn)錄(針對于熒光定量PCR)

K2381 劑盒(For Real-time PCR)      僅需15分鐘,即可完成熒光定量PCR所需的cDNA

SuperQuickRT MasterMix     即用型逆轉(zhuǎn)錄mix,只需加入RNA和水即可反應。僅

 

K2391   (for Real-Time PCR) 需15分鐘,即可完成熒光定量PCR所需的cDNA

K0688   Es Taq DNA Polymerase   兼具高擴增效率和高保真性的PCR產(chǎn)品

K0690   Es Taq MasterMix

K0957   UltraSYBR Mixture       熒光定量PCR—SYBR Green法

K0956   UltraSYBR Mixture(With ROX)  特異性強、Ct值低、定量更準確

 

 

實驗室代做實驗項目

 

滬公網(wǎng)安備 31011802001676號

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